引物不特异?尝试使用NCBI设计。
每天和分子生物学打交道的小伙伴,想必也经常被引物不特异搞的头晕脑胀,今天小编给大家推荐屡试不爽的引物设计方法,就是用NCBI在线设计,主要步骤如下:
1. 打开NCBI官网,在页面最下方找到“Primer-BLAST”,也可以直接点击()
2. 将目的基因序列粘贴在页面的框框里;
然后可以在“Primer Parameters”条目下将设置上下游起始位置,产物大小,退火温度等重要参数。
为了更好的设计出特异性引物,还可在“Primer Pair Specificity Checking Parameters”条目下将“Organism”后默认的人源种属更改为目的基因来源种属;
单击页面下方“Get Primers”,大功告成了
网站一般会反聩10条引物供选择,可以根据下列条件筛选引物吗,其实也没太大必要,小编直接选用前两对,没问题。
1)连续的相同碱基3;
2)GC占40% ~ 60%;
3)引物本身或两个引物不能有四个连续的碱基互补;
4)引物3’端尽量不要以“A”结尾,也要避免连续三个“G”或“C”。
初步验证引物特异性
(由于页面显示,设计结果页面给出的扩增结果有时并不是所有可能的扩增结果,因此需要通过Primer-BLAST再次验证)
打开“引物-BLAST”页面,在“引物参数”项下的两个框中输入所选引物的正向序列和反向序列。
修改底层引物扩增的基因物种,“获取引物”,等待数据库检测结果,根据结果判断是否有非特异性扩增,编辑经验,只要选择上面对应的物种,一般都没问题。